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上海信帆生物為大家提供:ELISA實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞樣本的收集方法

更新時(shí)間:2015-03-24      瀏覽次數(shù):1066

很多客戶在做ELISA實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,樣本是細(xì)胞樣本,大家對如何處理這個(gè)細(xì)胞樣本,都各有一套方法,今天上海信帆生物就把自己總結(jié)的一套方法分享給大家,希望有所幫助。

對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品:

1. 融解RIPA裂解液,混勻。取適當(dāng)量的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM

2. 對于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后,細(xì)胞就會被裂解。

對于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多,必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管,然后再裂解。

3. 充分裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGEWestern和免疫沉淀等操作。

裂解液用量說明:通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。

注:RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,屬正?,F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NF-kappaBp53等時(shí),通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

如果大家還有還有不清楚的地方,歡迎隨時(shí)咨詢。另外上海信帆生物還可以提供ELISA免費(fèi)代測服務(wù),歡迎。

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